Bir kofaktör, bir enzimin bir katalizör olarak aktivitesi için gerekli olan, bir kimyasal reaksiyonun hızını artıran, protein olmayan bir kimyasal bileşik veya metalik iyondur. Kofaktörler, biyokimyasal dönüşümlere yardımcı olan "yardımcı moleküller" olarak düşünülebilir. Kofaktörler tipik olarak, işlevlerini enzimlere bağlı kalarak yerine getirmeleri açısından ligandlardan farklılık gösterir.
Kofaktörler iki türe ayrılabilir: inorganik iyonlar ve koenzimler adı verilen karmaşık organik moleküller. Koenzimler çoğunlukla vitaminlerden ve diğer organik temel besinlerden küçük miktarlarda elde edilir. (Bazı bilim adamlarının "kofaktör" teriminin kullanımını inorganik maddelerle sınırladığına dikkat edin; burada her iki tip de yer almaktadır.)
Kofaktörsüz inaktif bir enzime apoenzim, kofaktörlü tam enzime ise holoenzim denir.
Bazı enzimler veya enzim kompleksleri birkaç kofaktör gerektirir. Örneğin, glikoliz ve sitrik asit döngüsünün birleşim yerindeki multienzim kompleksi piruvat dehidrojenaz , beş organik kofaktör ve bir metal iyonu gerektirir: gevşek şekilde bağlı tiamin pirofosfat (TPP), kovalent bağlı lipoamid ve flavin adenin dinükleotid (FAD), kosubstratlar nikotinamid adenin dinükleotid (NAD+) ve koenzim A (CoA) ve bir metal iyonu (Mg2+).
Organik kofaktörler genellikle vitaminlerdir veya vitaminlerden yapılırlar. ATP, koenzim A, FAD ve NAD+ gibi birçoğu yapılarının bir parçası olarak nükleotid adenozin monofosfatı (AMP) içerir. Bu ortak yapı, eski bir RNA dünyasındaki ribozimlerin bir parçası olarak ortak bir evrimsel köken yansıtabilir. Molekülün AMP kısmının, enzimin koenzimi farklı katalitik merkezler arasında değiştirmek için "kavrayabileceği" bir tür "kulp" olarak kabul edilebileceği öne sürülmüştür.