ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOTRANSFORMASYON ile 3-METİL BÜTANOLDEN
3-METİL BÜTİRİK ASİT ÜRETİMİ
Nursel GÜLSOY
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2000
Her hakkı saklıdır
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
BİYOTRANSFORMASYON ile 3-METİL BÜTANOLDEN
3-METİL BÜTİRİK ASİT ÜRETİMİ
Nursel GÜLSOY
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU
Biyotransformasyonla 3-metil bütirik asit, asetik asit bakterileri ile iki adımlı bir tepkime ile 3-metil bütanolden üretilmektedir. Bu tepkime adımlarını katalizleyen enzimler, hücre içi membrana bağlı alkol dehidrojenaz (ADH) ve aldehit dehidrojenaz (ALDH) enzimleridir. İlk adımda 3-metil bütanol, ADH enzimi ile katalizlenerek 3-metil bütanal üretilmektedir. İkinci adımda ise, 3-metil bütanal ALDH enzimi ile katalizlenerek 3-metil bütirik asit üretilmektedir.
Çalışmada ilk olarak ADH ve ALDH enzim analizleri yapılarak, tepkimeyi en yüksek verimle katalizleyen mikroorganizmanın seçimi amaçlanmıştır. Aktivite ölçümlerinin yapılabilmesi için, hücrenin parçalanarak hücre içi olan bu enzimlerin hücre dışına çıkartılması gerekmektedir. Bu doğrultuda maksimum parçalama hızına sahip ve laboratuvar koşulları için en uygun olan ultrasonik prosesör kullanılmıştır. Etkin bir parçalama gerçekleştirebilmek için, hücre parçalama koşullarının etkisi incelenmiştir. % 40 genlik ve 100 W akustik güç değerleri uygun koşullar olarak bulunmuştur. Ultrasonikasyon yöntemi geliştirilmiş, on farklı asetik asit bakterisi arasından Acetobacter pasterianus NRRL B-468’un en yüksek ALDH/ADH oranına sahip olduğu belirlenmiştir.
Bu on asetik asit bakterisi ile biyotransformasyon deneyleri gerçekleştirilmiş ve en yüksek 3-metil bütirik asit üretiminin de Acetobacter pasterianus NRRL B-468 ile gerçekleştiği görülmüştür.
Daha sonraki aşamada 3-metil bütirik asit üretimine on farklı karbon kaynağının etkisi incelenmiştir. Gliserol kullanımında, Acetobacter pasterianus NRRL B-468’in 3-metil bütanolün oksidasyonunda yüksek spesifik aktivite gösterdiği belirlenmiştir.
3-Metil bütirik asit üretimine, biyotransformasyon süresinin etkisi incelenmiştir. Uygun biyotransformasyon süresi 16 saat olarak belirlenmiştir.
3-metil bütirik asit üretiminde optimum biyo işletim parametrelerinin etkisi cevap yüzey yöntemi ile incelenmiştir. İncelenen parametreler; gliserol derişimi, PH, 3-metil bütanol derişimi ve karıştırma hızıdır. Cevap yüzey yöntemi ile gliserol derişimi: 10 g/L, pH: 6.1, 3-metil bütanol derişimi: 6.4 g/L ve karıştırma hızı: 135 rpm olarak bulunmuştur. Bu koşullarda üretilen optimum 3-metil bütirik asit derişimi 4.30 g/L’dir.
2000, 116 sayfa
Anahtar Kelimeler: Biyotransformasyon, asetik asit bakterileri, 3-metil bütanol, 3-metil bütirik asit, ultrasonikasyon, Cevap Yüzey Yöntemi
ABSTRACT
Master’s Thesis
PRODUCTION OF 3-METHYL BUTYRIC ACID
FROM 3-METHYL BUTANOL BY BIOTRANSFORMATION
Nursel GÜLSOY
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Chemical Engineering
Supervisor: Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU
3-Methyl butyric acid is produced by using acetic acid bacteria with two step reaction by biotransformation of 3-methyl butanol. The enzymes which catalyzed this reaction steps are alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). In the first step, 3-methyl butanol was catalyzed by ADH to produce 3-methylbutanal. In the second step, 3-methylbutanal was catalyzed by ALDH to produce 3-methyl butyrıc acid.
The first aim of this study was to choose the best microorganism which catalyse this reaction with the highest yield by analyzing ADH and ALDH enzymes . To determine the enzyme activity, intracelluar enzymes must be get out the cell by distruption the cell. This operation was achived by using ultrasonic processor To obtain effective distruption, the cell distruption conditions were investigated. The best conditions were defined as 40 % amplitude and 100 W acustic power. Using the ultrasonic method developed, Acetobacter pasterianus NRRL B-468 was chosen from ten different acetic acid bacteria because of its highest ALDH/ADH ratio.
Biotransformation experiments were carried by using these ten different acetic acid bacteria and the highest production of 3-methyl butyric acid was also achieved by Acetobacter pasterianus NRRL B-468.
Then the effect of ten different carbon source on the production of 3-methyl butyric acid was investigated. Acetobacter pasterianus NRRL B-468 showed high spesific activity when glycerol was used as carbon source. The effect of the biotransformation time on the production of 3-methyl butyric acid was investigated and the best time was 16 hours.
In the production of 3-methyl butyric acid, the optimum bioproces parameters were investigated by Response Surface Methodology (RSM). The investigated parameters were, glycerol concentration, pH, initial 3-methyl butanol concentration and stirring rate. The optimum conditions were thus found to be 10 g/L of initial glycerol concentration, pH=6.1, 6.4 g/L of initial 3-methyl butanol concentration and 110 rpm stirring rate. Optimum 3-methyl butyric acid production under these conditions was found 4.30 g/L
2000, 116 pages
Key Words: Biotransformation, acetic acid bacteria, 3-methyl butanol, 3-methyl butyric acid , ultrasonication, Response Surface Methodology.
TEŞEKKÜR
Biyotransformasyonla 3- metil bütanolden bir aroma maddesi olan 3-metil bütirik asit üretiminin gerçekleştiği bu çalışma Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu Müdürlüğü tarafından 98-05-04-13 no’lu proje kapsamında desteklenmiştir.
Çalışmamda araştırma olanağı sağlayan ve önerileri ile çalışmamı yönlendiren danışman hocam, Sayın Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi)’na, yönlendirme ve yardımları ile çalışmam boyunca yanımda olan ve bana bilimsel düşünmeyi öğreten Sayın Dr. Hamdi KAPUCU (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi)’ya ve güzel dostluklarını paylaştığım Biyoteknoloji ve Süperkritik Araştırma Grubu’ndaki arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Nursel GÜLSOY
Ankara, Haziran 2000
İÇİNDEKİLER
ÖZET................................................................................................... i
ABSTRACT.......................................................................................... iii
TEŞEKKÜR.......................................................................................... v
SİMGELER DİZİNİ ............................................................................. x
ŞEKİLLER DİZİNİ .............................................................................. xii
ÇİZELGELER DİZİNİ.......................................................................... xv
1.GİRİŞ............................................................................................ 1
2.KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI....... 6
2.1. Biyotransformasyon ................................................................... 6
2.1.1. Biyotransformasyonun Avantajları ve Kullanım Alanları......... 6
2.1.1.1. Optikçe Aktif Merkezlerin Ortaya Çıkması........................... 8
2.1.1.2. Rasemiklerin Ayırılması....................................................... 9
2.1.1.3. Benzer Reaktifler ile Birkaç Grup Arasında Fonksiyonel
Grup Seçimi......................................................................... 9
2.1.1.4. Ilımlı Reaksiyon Koşulları.................................................... 9
2.2. Biyotransformasyon Proseslerinin Gerçekleşmesi İçin
Yöntemler.................................................................................. 10
2.2.1. Büyüyen Kültür ile.Biyotransformasyon................................... 10
2.2.2. Önceden Büyütülmüş Hücreler ile Biyotransformasyon............ 10
2.2.3. Tutuklanmış Hücreler ile Biyotransformasyon ........................ 10
2.2.4. Saf Enzimler ile Biyotransformasyon....................................... 11
2.2.5. Çok fazlı sistemler ile biyotransformasyon .............................. 12
2.3. Asetik Asit Bakterileri................................................................ 13
2.3.1. Acetobacterler......................................................................... 13
2.3.2. Gluconobacterler.................................................................... 14
2.3.3. Alkol Dehidrojenaz ve Aldehit Dehidrojenaz Enzimleri.......... 16
2.4. 3-Metil Bütirik Asit................................................................... 17
2.4.1. 3-Metil Bütirik Asidin Özellikleri........................................... 17
2.4.2. 3-Metil Bütirik Asit Üretimi................................................... 18
2.4.3. 3-Metil Bütirik Asidin Kullanım Alanları............................... 18
2.5. Hücre Parçalama Yöntemleri...................................................... 19
2.5.1. Hücre Parçalanması İçin Mekanik Olmayan Yöntemler........... 21
2.5.2. Hücre Parçalaması İçin Mekanik Yöntemler............................ 22
2.5.2.1. Ultrasonikasyon.................................................................... 23
2.5.2.1.1. Hücre Parçalanma Kinetiği................................................ 24
2.5.3. Hücre Parçalanmasının Belirlenmesi....................................... 27
2.6. Cevap Yüzey Yöntemi (RSM).................................................... 29
2.7. Kaynak Araştırması.................................................................... 46
3. MATERYAL ve YÖNTEM........................................................ 54
3.1. Mikroorganizma ve Üretim Koşulları......................................... 54
3.2. Mikroorganizma Derişiminin Belirlenmesi................................. 54
3.3. Protein Analizi........................................................................... 55
3.4. Hücre Parçalama Yöntemi.......................................................... 56
3.5. Hücre Yaşayabilirlik Analizi...................................................... 58
3.6. Alkol Dehidrojenaz (ADH) ve Aldehit Dehidrojenaz (ALDH)
Aktivite Ölçüm Yöntemleri........................................................ 58
3.7. Biyotransformasyon Deneyleri.................................................... 60
3.8. 3- Metil Bütanol, 3- Metil Bütanal ve 3- Metil Bütirik Asit
Analizleri .................................................................................. 60
3.9. Deneysel Tasarım Yöntemi ile 3- Metil Bütirik Asit Üretiminde
Optimum Koşullarının Belirlenmesi........................................... 61
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA............................ 63
4.1. Ultrasonikasyon İşletme Parametreleri........................................ 63
4.1.2. Geliştirilmiş Ultrasonikasyon Yöntemi.................................... 67
4.2. Biyotransformasyon Parametrelerinin İncelenmesi..................... 71
4.2.1. Mikroorganizma Seçimi.......................................................... 71
4.2.2. Karbon Kaynağı Seçimi........................................................... 73
4.2.3 Biyotransformasyon SüresininBelirlenmesi............................... 74
4.2.4. Cevap Yüzey Yöntemi (RSM) Kullanılarak 3-Metil Bütirik
Asit Üretimi İçin Optimum Koşulların Belirlenmesi................. 76
4.2.4.1.Gliserol Derişimi ve pH Etkisi............................................... 80
4.2.4.2. Gliserol Derişimi ve 3-Metil Bütanol Derişimi Etkisi............ 82
4.2.4.3. Gliserol Derişimi ve Karıştırma Hızının Etkisi..................... 84
4.2.4.4. pH ve 3-Metil Bütanol Derişimi Etkisi ................................. 86
4.2.4.6.pH ve Karıştırma Hızı Etkisi................................................. 88
4.2.4.7. 3-Metil Bütanol Derişimi ve Karıştırma Hızı Etkisi ............ 90
4.2.4.8. Cevap Yüzey Yöntemi ile Bağımsız Değişkenlerin
Optimum Değerlerinin Belirlenmesi..................................... 92
5. SONUÇ........................................................................................ 94
KAYNAKLAR...................................................................................... 96
EKLER
EK 1. Çalışmada Kullanılan Mikroorganizmalar İçin Yaş ve Kuru
Kalibrasyon Grafikleri ............................................................ 99
EK 2. Protein Kalibrasyon Grafiği..................................................... 109
EK 3. 3-Metil Bütanol, 3-Metil Bütanal ve 3-Metil Bütirik Asit
. Kalibrasyon.Grafikleri............................................................ 110
EK 4. Acetobacter pasteriuanus NRRL B-468 Üreme Eğrisi............. 113
EK.5. . 24 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda
mikroorganizma derişimi................................................ 114
EK 6. 24 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda pH
değişimi ve mikroorganizma derişimi................................ 115
EK 7. 16 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda pH
değişimi ve mikroorganizma derişimi................................ 115
ÖZGEÇMİŞ.......................................................................................... 116
SİMGELER DİZİNİ
b : Katsayı matrisi
bi : Regresyon eşitliğinde i’inci katsayısı
C : Hücre
CiA : 3-Metil Bütanol derişimi (g/L)
CALD : 3-Metil Bütanal derişimi (g/L)
CALK : 3-Metil Bütanol derişimi (g/L)
CAST : 3-Metil Bütirik derişimi (g/L)
Cs : Substrat derişimi (g/L)
Cx : Hücre derişimi (g/L)
Es : Yüzey kuvveti (dyn/cm2)
f1 : Eşitlik 2.46 ile tanımlanan toplam serbestlik derecesi
f2 : Eşitlik 2.47 ile tanımlanan hata serbestlik derecesi
f3 : Eşitlik 2.48 ile tanımlanan model serbestlik derecesi
F : Eşitlik 2.44. ile tanımlanan Fisher değişim oran testi
FN : Yaşayan hücre kesri
k : Bağımsız değişken sayısı
no : Merkezi noktada yapılan deney sayısı
N : Eşitlik 2.18. ile tanımlanan deney sayısı
DP : Kesme gerilimi (dyn/cm2)
R2 : Koralasyon katsayısı
S0 : Mikroorganizma üretim sonrası yapılan santrifüjün süzüntü
kısmı
S1 : Birinci sonikasyon adımından sonra yapılan santrifüjün süzüntü
kısmı
S2 : İkinci sonikasyon adımından sonra yapılan santrifüjün süzüntü
kısmı
S3 : Üçüncü sonikasyon adımından sonra yapılan santrifüjün süzüntü
Kısmı
Sbi : Eşitlik 2.43. ile tanımlanan i katsayının standart sapması
Se2 : Eşitlik 2.40. ile tanımlanan hata karelerinin toplamı
Si : Örnek varyansları
Smax : Örnek varyanslarının maksimum değeri
Sr2 : Eşitlik 2.45 ile tanımlana farkların karelerinin toplamı
t : Ultrasonikasyon zamanı (dk)
T : Sıcaklık (°C)
U : r uzunluğu boyunca dalganın hızı (m/s)
xi : Eşitlik 2.12.’deki bağımsız değişkenler
xs : Eşitlik 2.59 ile tanımlanan normelize edilmiş bağımsız değişken
X : Eşitlik 2.22. ile tanımlanan bağımsız değişken matrisi
X* : X matrisinin transpozu
w : Eşitlik 2.58’de dönüştürülmüş bağımsız değişken
W : Dönüştürülmüş bağımsız değişken
y : Cevap fonksiyonu
Y : Eşitlik 2.23. ile tanımlanan bağımlı değişken
m : Kavitasyon ortamının viskozitesi (N/m2)
g : Yüzey gerilim kuvvet (dyn/cm2)
bo : Eşitlik 2.14.’ün bağımsız terimi
bi : Eşitlik 2.14.’ün doğrusal terimi
bii : Eşitlik 2.14.’ün ikinci derece terimi
bij : Eşitlik 2.14.’ün iç etkileşim terimi
eio :Eşitlik 2.15.’de boyutsuz koordinat sisteminde merkezi noktadaki
bağımsız değişken
ei : Eşitlik 2.15.’de boyutsuz koordinat sistemindeki bağımsız
değişken
ADH : Alkol dehidrojenaz enzimi
ALDH : Aldehit dehidrojenaz enzimi
SSE : Hata kareleri toplamı
SSM : Model kareleri toplamı
SST : Toplam hata karelerinin toplamı
MSM : Model karelerinin oranı
MSE : Hata karelerinin oranı
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Biyotransformasyon ile 3-metil bütanolden 3-metil bütirik
asit üretimi............................................................................. 18
Şekil 2.2. Genel hücre parçalama yöntemleri......................................... 21
Şekil 2.3. G. Oxydans, A. Sp. A ve A. sp. AB2 türü mikroorganizmalar
ile 2-fenil etanolden 2-fenil asetaldehit üretimi .................... 46
Şekil 3.1 Ultrasonik Prosesör................................................................. 57
Şekil 4.1. Ultrasonikasyon İşleminde Sıcaklık Artışı............................. 63
Şekil 4.2.. Ultrasonikasyonda İşletme Faktörü ..................................... 64
Şekil 4.3. Farklı akustik güç değerlerinde ln[1]’in t ile
değişimi ................................................................................ 65
Şekil 4.4. Farklı pH değerleri için ln[2]’in t ile
değişimi ................................................................................ 67
Şekil 4.5. Ultrasonikasyonda izlenen yol............................................... 69
Şekil 4.6.Farklı fraksiyonlardaki bağıl ADH aktivitesi ......................... 70
Şekil 4.7.Farklı fraksiyonlardaki bağıl ALDH aktivitesi ..................... 70
Şekil 4.8. Farklı asetik asit bakterileri ile 3-metil bütirik asit üretimi..... 73
Şekil 4.9. 3- Metil bütirik asit üretimine karbon kaynaklarının etkisi .... 74
Şekil 4.10. 3-Metil bütirik asit üretimine biyotransformasyon
süresinin etkisi...................................................................... 75
Şekil 4.11. 3- Metil bütirik asit üretimine gliserol derişimi ve pH’ın
etkisi ve iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler sıfır
seviyesinde tutulmuştur......................................................... 80
Şekil 4.12. 3-Metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi. gliserol
ve pH’ın etkisi ve iç etkileşimleri. Diğer değişkenler
sıfır seviyesinde tutulmuştur................................................. 81
Şekil 4.13. 3- Metil bütirik asit üretimine gliserol derişimi ve pH’ın
etkisi ve iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler
sıfır seviyesinde tutulmuştur................................................. 82
Şekil 4.14. 3- Metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi. gliserol
ve 3-metil bütanol derişiminin etkisi ve iç etkileşimleri.
Diğer değişkenler sıfır seviyesinde tutulmuştur..................... 83
Şekil 4.15. 3- Metil bütirik asit üretimine gliserol derişimi ve pH’ın
etkisi ve iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler sıfır
seviyesinde tutulmuştur........................................................ 84
Şekil 4.16. 3-Metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi, gliserol
ve karıştırma hızının derişiminin etkisi ve iç etkileşimleri.
Diğer değişkenler sıfır seviyesinde tutulmuştur..................... 85
Şekil 4.17. 3- Metil bütirik asit üretimine pH ve 3-metil bütanol etkisi
ve iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler sıfır
seviyesinde tutulmuştur........................................................ 86
Şekil 4.18. 3-metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi, pH ve
3-metil bütanol derişiminin etkisi ve iç etkileşimleri.
Diğer değişkenler sıfır seviyesinde tutulmuştur..................... 87
Şekil 4.19. 3- Metil bütirik asit üretimine pH ve karıştırma hızı etkisi
ve iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler sıfır
seviyesinde tutulmuştur........................................................ 88
Şekil 4.20.. 3-metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi, pH ve
karıştırma hızının etkisi ve iç etkileşimleri. Diğer
değişkenler sıfır seviyesinde tutulmuştur............................. 89
Şekil 4.21 3- Metil bütirik asit üretimine 3-metil bütanol ve karıştırma
hızı iç etkileşimlerin çizimi. Diğer değişkenler sıfır
seviyesinde tutulmuştur........................................................ 90
Şekil 4.22. 3-Metil bütirik asit üretiminin üç boyutlu çizimi, 3-metil
bütanol derişimi ve karıştırma hızının etkisi ve iç
etkileşimleri. Diğer değişkenler sıfır seviyesinde
tutulmuştur........................................................................... 91
Şekil EK 1.1. Acetobacter pasteurianus NRRL B-45 yaş hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 99
Şekil EK 1.2. Acetobacter pasteurianus NRRL B-45 kuru hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 99
Şekil EK 1.3. Acetobacter orleance NRRL B-55 yaş hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 100
Şekil EK 1.4. Acetobacter orleance NRRL B-55 kuru hücre
kalibrasyon grafiği ......................................................... 100
Şekil EK 1.5. Acetobacter pasterianus NRRL B-56 yaş hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 101
Şekil EK 1.6. Acetobacter pasterianus NRRL B-56 kuru hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 101
Şekil EK 1.7. Gluconobacter oxydans NRRL B-63 yaş hücre
kalibrasyon grafiği ......................................................... 102
Şekil EK 1.8. Gluconobacter oxydans NRRL B-63 kuru hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 102
Şekil EK 1.9. Acetobacter pasteurianus NRRL B-65 yaş hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 103
Şekil EK 1.10. Acetobacter pasteurianus NRRL B-65 kuru hücre
kalibrasyon grafiği.......................................................... 103
Şekil EK 1.11. Gluconobacter oxydans NRRL B-72 yaş hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 104
Şekil EK 1.12. Gluconobacter oxydans NRRL B-72 kuru hücre
kalibrasyon grafiği ....................................................... 104
Şekil EK 1.13. Acetobacter oxydans NRRL B-147 yaş hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 105
Şekil EK 1.14. Acetobacter oxydans NRRL B-147 kuru hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 105
Şekil EK 1.15. Acetobacter pasteurianus NRRL B-468 yaşhücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 106
Şekil EK 1.16. Acetobacter pasteurianus NRRL B-468 kuru hücre
kalibrasyon grafiği ........................................................ 106
Şekil EK 1.17. Acetobacter aceti NRRL B-469 yaş hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 107
Şekil EK 1.18. Acetobacter aceti NRRL B-469 kuru hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 107
Şekil EK 1.19. Acetobacter pasteurianus NRRL B-570 yaş hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 108
Şekil EK 1.20. Acetobacter pasteurianus NRRL B-570 kuru hücre
kalibrasyon grafiği........................................................ 108
Şekil EK 2.1.Protein kalibrasyon grafiği................................................ 109
Şekil EK 3.1. 3-metil bütanol kalibrasyon grafiği.................................. 110
Şekil EK 3.2. 3-metil bütanal kalibrasyon grafiği.................................. 111
Şekil EK 3.3. 3-metil bütirik asit kalibrasyon grafiği............................. 112
Şekil EK 4. Acetobacter pasteriuanus NRRL B-468 Üreme Eğrisi........ 113
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 1.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması Yıllık Tüketim
Miktarları ve Karakteristik Özellikleri ............................... 3
Çizelge 2.1 Enzimlerin Katalizlediği Kimyasal Reaksiyonların
Sınıflandırılması .............................................................. 7
Çizelge 2.2 Biyotransformasyon verimi ................................................ 8
Çizelge 2.3. Acetobacter ve Gluconobacter Türleri Arasındaki
KarakteristikFarklar.......................................................... 15
Çizelge 2.4. 3-metil bütirik asidin özellikleri......................................... 17
Çizelge 2.5.. Endüstiriyel hücre içi enzimler ve kullanım alanları......... 19
Çizelge 2.6. Deneysel tasarım matrisi ................................................... 31
Çizelge 2.7. Farklı faktörler için a ve n0 değerleri................................. 32
Çizelge 2.8. Kullanılan modelin ANOVA testi...................................... 42
Çizelge 2.9. Asetik asit bakterileri ile farklı substratların % molar
dönüşümleri....................................................................... 48
Çizelge 2.10. Biyodönüşüm verimine alkol molekül yapısının etkisi...... 49
Çizelge 2.11. İzomerik (orta, meta, para) sübstitient benzil
alkollerin karşılaştırılması................................................ 51
Çizelge 2.12. Asetaldehit üretim hızına asetaldehit derişimi
etkisi................................................................................ 52
Çizelge 2.13. Asetaldehit üretimine Tris tamponu derişimi etkisi ......... 52
Çizelge 3.1. Gaz kromotografi analiz şartları........................................ 60
Çizelge 3.2. Bağımsız Değişkenlerin Seviye ve Aralıkları..................... 61
Çizelge 3.3. Deneysel Tasarım Matrisi.................................................. 62
Çizelge 4.1. Akustik gücün % yaşayabilirliliğe etkisi............................. 64
Çizelge 4.2. pH değişiminin % yaşayabilirliliğe etkisi. ......................... 66
Çizelge 4.3. Acetobacter ve Gluconobacter Türleri İçin Yapılan
İnceleme Sonuçları. ........................................................... 72
Çizelge 4.4. Deneysel sonuçlar.............................................................. 77
Çizelge 4.5. Kullanılan modelin ANOVA testi...................................... 78
Çizelge 4.6. En küçük kareler yöntemi ile bulunan katsayılar
ve istatistiksel hesaplamaları............................................ 78
Çizelge 4.7. Yüzey cevap yönteminde deneysel ve modelden hesaplanan
3-metil bütirik.asit derişimleri ve aralarındaki fark ........... 92
Çizelge 4.8. Cevap Yüzey Yöntemi kullanılarak 3-metil bütirik asit
üretimi için belirlenen optimum koşullar .......................... 93
Çizelge EK.5. 24 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda
mikroorganizma derişimi............................................... 114
Çizelge EK 6. 24 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda pH
değişimi ve mikroorganizma derişimi.............................. 115
Çizelge EK 7. 16 saatlik biyotransformasyon süresi sonunda pH
değişimi ve mikroorganizma derişimi.............................. 115
KAYNAKLAR
Adachi O., Tayama K., Shinagawa E., Matsushita K. and Ameyama, M. 1978. Purification and Characterization of Particulate Aldehyde Dehydrogenase from Gluconabacter suboxyydans. Agric. Biol.Chem., 44 (3); 503-515.
Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. and Ameyama, M. 1978. Purification and Characterization of Particulate Alcohol Dehydrogenase from Gluconabacter suboxyydans. Agric. Biol.Chem., 42 (11); 2045-2056.
Adachi O., Ameyama, M. 1982. Alcohol Dehydrogenase from Acetic Acid
Bacteria,
Membrane-Bound, Methods in Enzymology, 89, 451-457 and
491-497
Asai, T. 1968. Acetic Acid Bacteria. Univ. of Tokyo Press, 5-129
Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the princible of protein-dye binding. Analitical Biochemistry, 72; 248-254.
Brink, L. E. S., Tramper, J., Luyben K.C. A. M. and Van’t Riet K. 1988. Enzyme Micrb. Technol., 10, 736-743
Burdock, G.A. 1995. Fenarolı’s Hadnbook of Flavor Ingradients, Vol.2, 3rd ed. 376 and 424, CRS Press, London.
Dakubu, S. 1976. Cell inactivation by ultrasound, Biotechnol. Bioeng, 18, 465-471
Doulah, M.S. 1978. Mechanism of Disintegration of Biological Cells in Ultrasonic Cavitation. Biotech. Bioneng, 19; 649-660.
Doulah, M.S. 1981. Cell Disintegration by Ultrasonic Cavitation. Process. Biochem., 16; 26-27.
Druaux D., Mangeot G., Endrizzi A. and Belin J.M. 1997. Bacterial Bioconversion of Primary Aliphatic and Aromatic Alcohols into Acids: Effects of Molecular Structure and Physico-chemical Conditions. J.Chem.Tech. Biotechnol., 68; 214-218.
Duff, S.J.B. and Murray, W.D. 1988. Production and Application of Methylotrophic Yeast Pichia pastoris. Biotechnology and Bioengineering., 31; 44-49.
Duff, S.J.B. and Murray, W.D. 1989. Oxidation of Benzyl Alcohol by Whole Cells of Pichia pastoris and by Alcohol Oxidase in Aqueous and Nonaqueous Reaction Media. Biotechnology and Bioengineering, 34; 153-159.
Feliu J.X. and Villaverde A. 1994. Optimized Ultrasonication Protocol for Bacterial Cell Distruption and Recovery of b-Galactosidase Fusion Proteins. Biotech. Technol., 8; 509-514.
Feliu J.X., Villaverde A. and Cubarsi R. 1997. Optimized Release of Recombinat Protein by Ultrasonication of E. coli Cells. Biotech. Bioeng., 58 (6); 536-540.
James, C. J., Coakley, W. T. and Hughes, D. E. 1972. Kinetics of protein release from yeast sonicated in batch and flow system at 20 kHz. Biotechnol. Bioeng., 16, 33-42
Kapucu, H. 1997. Biyotransformasyon, Doktora Semineri, Ankara
Kinsole, H. Ackerman E. and Reid, J. S. 1954. Exposure of microorganisms to measured sound fields, J. Bacteriol., 68, 373-380
Kieslich, K. 1984. Biotechnology. Verlag Chemie, 1-4, Germany
Leuenberger, H.G.W. 1992. Biotransformations Applied To The Synthesis of Vitamins and Pharmaceuticals, (ed. S. Servi, Microbial Reagents in Organic Synthesis) Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 149-158.
Lilly, M.D. 1994. Advanced in Biotransformation Processes. Chemical Engineering Science, 49 (2); 151-159.
Manzoni M., Molinari F., Tirelli A. and Aragozzini F. 1993. Phenylacetaldehyde by Acetic Acid Bacteria Oxidation of 2-Phenlylethanol. Biotechnol. Lett., 15; 341-346.
Molinari F., Villa R., Manzoni M. and Aragozzini F. 1995. Aldehyde Production by Alcohol Oxidation with Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 989-994.
Molinari F., Villa R., Aragozzini F., Cabella, P., Barbeni, M. and Squarcia, F. 1997. Multigram-Scale Production of Aliphatic Carboxylic Acids by Oxidation of Alcohols with Acetobacter pasterianus NCIMB 11664. J. Chem. Technol. Biotechnol., 70, 294-298.
Montgomery, D.C. 1996. Design and analysis of Experiments, John Wiley and Sons 4th Ed., USA, 575-651
Myers R.M. 1971. Response Surface Methodology, Allyn and Bacob Inc., 67-106, Boston.
Sato, T., Nishida. Y. T. and Chibata, I. 1979, Immobilization of Escherichia coli Cells Containing Aspartase Activity with K. carrageennan Enzymatic Properties and Application for L- Aspartic Acid Production. Biochim. Biophys. Acta, 570; 179-186
Simmonds, J. and Robinson, G.K. 1998. Formation of Benzaldehyde by Pseudomonas putida ATCC 12633. Appl. Microbiol. Biotechnol., 50; 353-358.
Tramper, J. 1996. Chemical Versus Biochemical Conversion: When and
How to Use Biocatalysis, Biotechnology and Bioengineering,
52, 290-295
Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L. Dunnill. 1979. Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley Sons, USA
Welsh, F. W., Murray, W. D., Williams, R. E., 1989. Microbiological and Enzymatic Production of Flavor and Fragrance Chemicals. Critical Reviews in Biotecnology., 9; 105-169
Wheelwright, S. M. 1991.Protein Purification: Design and Scale up of Downstream Processing.Oxford Uni. Press, 64-71, New York
Wimpenny, J.W.T. 1967. Breakage of Microorganisms. Process. Biochem., 2(7); 41.
ÖZGEÇMİŞ
1974 yılında Sivas’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini İstanbul’da tamamladı. 1992 yılında girdiği Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nden 1996 yılında Kimya Mühendisi ünvanıyla mezun oldu. Ekim 1996-Haziran1997 döneminde Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsünde İngilizce hazırlık programını tamamladı. Ekim 1997-Temmuz 2000 yılları arasında Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans öğrenimini tamamladı.